摘要：结合国外粪大肠菌群的酶底物检测方法，针对某次突发环境污染事件，用酶底物法和标准多管发酵法同步检测受污染地表水中的粪大肠菌群，讨论酶底物法在应急检测中检测粪大肠菌群的适用性。结果表明，两种方法的测定数据显著相关，没有统计学差异ρ＞0.05。相对于多管发酵法，酶底物法特异性强，检测时间短，二次污染少，符合应急检测的要求。
应急监测指突发环境事件发生后,对污染物种类、浓度和污染范围进行的监测。
粪大肠菌群又称耐热大肠菌群,是水质污染的重要指标之一,也是环境质量标准和排放标准中不可缺少的控制指标之一。快速、准确地检测粪大肠菌群直接关系突发水环境污染事件中水体的粪便污染评价,以及采取的应急措施和生活用水的安全。
在目前国内已颁布的相关标准中,粪大肠菌群检测多选用经典方法多管发酵法和滤膜法,操作较繁琐,需要48h~72h才能获得结果,难以满足突发性环境污染事故监测及时、准确的要求。酶底物法是一种新型酶技术检测方法,2003年从美国引入我国,用于大肠杆菌检测。该方法利用粪大肠菌群在44.5℃生长过程中产生的β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解培养液中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG),使培养液呈现黄色反应(阳性),从而指示粪大肠菌群的存在。
在美国,90%以上的实验室使用酶底物检测技术;在加拿大、日本的饮用水市场,酶底物法的使用率高于其他检测方法的总和;在我国,该法也日益普及,拥有相关设备的各级环境监测站达百余家,目前已作为检测水中总大肠菌群的标准方法列入《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)。使用酶底物法检测水中粪大肠菌群尚未正式列入国家标准,使酶底物法的应用范围受到限制。
为了建立粪大肠菌群简单、准确的快速检测法,以标准中的Colilertech酶底物法为基础,通过某水体一次污染事故中粪大肠菌群的连续监测过程分析,将酶底物法与多管发酵法作比对,探讨粪大肠菌群酶底物快速检测法在应急监测中运用的可行性,为酶底物法行业标准的编制提供技术参考。
1研究方法和设备
1.1仪器高压灭菌器1台,培养箱2台,立科封口机,移液器,振荡器等。
1.2样品水样来源于受污染的地表水,按照《水质采样技术指导》(HJ494-2009)的规定采集约
500mL水样,置于灭菌采样瓶中,在0℃~4℃低温保存,送至实验室分析。
1.3检测方法
1.3.1酶底物法基于标准中的Colilertech酶底物法,培养基由西安立科公司提供。目前立科酶底物培养基已经获得《水和废水标准检验法》认可。检测时用100mL无菌稀释瓶量取100mL水样,加入(2.7±0.5)g培养基粉末,混摇均匀使其完全溶解后,全部倒入97孔无菌定量盘内,用立科封口机封口,放入培养箱中于(44.5±1)℃培养24h后判读结果。
2试验结果和分析
2.1试验结果共采集124个水样,分别用酶底物法和多管发酵法测定粪大肠杆菌,结果见图1,线性回归分析见图2。由图2可见,两种方法的测定数据在指数水平上呈现明显的一致性,测定结果之间有较好的趋势性,线性回归方程为y=1.3355x-209.77,R2为0.7588,相关性较为显著。


2.2可信度检验分别用NSI公司和ERA公司提供的粪大肠菌群质控标样,对酶底物法和多管发酵法进行方法质控,阴性检测和阳性检测的结果见表1。由表1可见,酶底物法和多管发酵法的检测结果均在质量控制可信度区间内,可用于后续实验分析。
2.3两种方法比对分析运用SPSS17.0统计软件,对酶底物法和多管发酵法做配对t检验分析,结果见表2。表1两种方法的可信度检验MPN/100mL方法检测结果QC值置信范围结果评判酶底物法(NSI公司)579681182~2560良好多管发酵法(ERA公司)490797346~1250良好表2两种方法的t检验结果Table2ttestofthetwomethods成对差分均值标准差均值的标准误差差分的95%置信区间下限上限t值dfP值-0.044200.663800.05961-0.162200.07379-0.7421230.460

由表2可见,两种方法的相关度为0.836,P值为0.460,表明二者相关性良好,两种方法无显著性差异。
因此,将酶底物法用于环境中粪大肠菌群检测,方法可行,结果可信。
2.4环境标准判读根据《地表水环境质量标准》(GB3838-2002),对124个样品的酶底物法和多管发酵法检测结果作标准评判比较,变化率为0.8%~6.5%,在可接受范围内(见表3)。此次被检样品的水质介于Ⅱ类~Ⅴ类之间,与上海地区地表水粪大肠菌群评价结果的范围基本一致。表3酶底物法和多管发酵法的标准评判比较

水质标准类别Ⅰ类Ⅱ类Ⅲ类Ⅳ类Ⅴ类(劣Ⅴ类)酶底物法样品数n/个7702423占比/%5.656.519.418.5多管发酵法样品数n/个5632531占比/%4.050.820.225.03讨论从结果一致性的角度,酶底物法与多管发酵法没有统计学意义上的差异,此次样品检测结果与文献报道的多管发酵法与酶底物法的比对试验结果具有较好的一致性。从检测原理上分析,多管发酵法主要基于粪大肠杆菌分解乳糖产酸产气的生化原理,而酶底物法则应用酶技术,利用粪大肠杆菌产生β-半乳糖苷酶,分解邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷使培养基显色的原理检测,反应专性更强。因此,相对于多管发酵法15%的假阳性和10%的假阴性,酶底物法出现假阴性和假阳性的现象较少,仅占2%。从实验操作的角度,多管发酵法需要重复接菌,造成污染的几率较大,而酶底物法取样加药后封口培养,过程简单,较少受人为污染。

从检测结果分析,虽然二者均采用较大可能数法,但多管发酵法的较大可能数表仅有56组,该试验采用的酶底物法97孔定量盘的较大可能数表有2352组,其统计概算结果更加准确。由此可见,与多管发酵法相比,酶底物法操作简便,检测速度较快,二次污染少,准确性较高。虽然酶底物法材料成本略高,但综合考虑管理和人员成本,仍在可接受范围内,可以作为应急环境监测中微生物污染的快速监测方法。两种方法的比较见表4。

采用酶底物法检测粪大肠菌群时,需注意以下几点:
(1)样品的均匀性。水样需摇匀,并尽快与培养基混合,否则可能导致结果差异性很大,丧失方法的稳定性优势。
(2)稀释比的合理性。研究发现,水样稀释倍数越高,酶底物法的测定值越偏低。因此,在日常检测工作中,应根据具体情况对水样做小倍数稀释,使结果更加准确、真实。
(3)培养温度的恒定性。样品在培养箱中于44.5℃培养,误差控制在±0.5℃,温度偏低或偏高都直接影响检测结果。
检测方法操作步骤场所和人员要求确认实验检测时间准确度检测费用推广度多管发酵法繁琐专业场所和人员需要48h~72h较准确较便宜易酶底物法简易要求不高不需要24h准确较便宜。
4结语
酶底物法以粪大肠菌群的特异性酶与特异性底物产生特异反应为原理,具有检测快速、准确的特点。方法操作简便,检测周期短,能准确判断水样受粪便污染状况,符合突发性环境应急监测实时、快速、准确的要求,将得到更为广泛和标准化的应用。粪大肠菌群酶底物法在环境应急监测中的应用结合国外粪大肠菌群的酶底物检测方法,针对某次突发环境污染事件,用酶底物法和标准方法多管发酵法同步检测受污染地表水中的粪大肠菌群,讨论酶底物法在应急监测中检测粪大肠菌群的适用性。结果表明,两种方法的测定数据显著相关,没有统计学差异(P>0.05)。相对于多管发酵法,酶底物法特异性强,检测时间短,二次污染少,符合应急监测的要求。