生活饮用水标准检验方法微生物指标GBT5750.12-20
菌落总数
1.1平皿计数法
1.1.1范围
本标准规定了用平皿计数法测定生活饮用水及其水源水中的菌落总数。
本法适用于生活饮用水及其水源水中菌落总数的测定。
1.1.2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
1.1.2.1菌落总数 standard plate-count bacteria
水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48H后，所得1ml水样所含菌落的总数。
1.1.3培养基与试剂
1.1.3营养琼脂
1.1.3.1.1 成分：
A 蛋白胨 10g
B 牛肉膏 3g
C 氯化钠 5g
D 琼脂 10g-20g
E 蒸馏水 1000ml
1.1.3.1.2 制法：将上述成分混合后，加热溶解，调整PH为7.4-7.6，分装于玻璃容器中（如用含杂质较多的琼脂时，应县过滤），经103.43kpa(121℃，15Ib)灭菌20min,储存于冷暗处备用。
1.1.4 仪器
1.1.4.1 高压蒸汽灭菌器
1.1.4.2 干热灭菌箱
1.1.4.3 培养箱36℃±1℃。
1.1.4.4 电炉。
1.1.4.5 天平。
1.1.4.6 冰箱。
1.1.4.7放大镜或菌落计数器
1.1.4.8PH计或精密PH试纸。
1.1.4.9灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等。
1.1.5检验步骤
1.1.5.1生活饮用水
1.1.5.1.1以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。
1.1.5.1.2 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培养箱内培养48h，进行菌落计数，即为水样1ml中的菌落总数。
1.1.5.2 水源水
1.1.5.2.1 以无菌操作方法吸取1ml充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:10稀释液。
1.1.5.2.2吸取1:10稀释液1mL注入盛有9mL灭菌胜利盐水中的试管中，混匀成1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000,1:10000稀释液等备用。如此递增稀释一次，必须更换一支1ml灭菌吸管。
1.1.5.2.3用灭菌吸管取未稀释的水样和2个~3个适宜稀释度的水样1ml，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。
1.1.6菌落计数及报告方法
作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。
1.1.7不同稀释度的选择及报告方法
1.1.17.1 先选择平均菌落数在30-300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围内，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例 1）
1.1.7.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数（如表1中实例2）。若大于2则报告其中稀释度较小的菌落数（如表1中实例3）。若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数（见表1实例4）。
1.1.7.3 若所有稀释度的平均菌落数大于300，则应按稀释度高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例5）。
1.1.7.4 若所有稀释度的平均菌落数小于30，则应以稀释度低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例6）。
1.1.7.5 若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则应以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例7）
1.1.7.6 若所有稀释度的平板上均无菌落声场，则以未检出报告之。
1.1.17.7 如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度大的平板上，任意数其中2个平板1cm2中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2,再乘其稀释倍数做报告。
1.1.7.8菌落技术的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（见表1“报告方式”栏）。
表一 稀释度选择及菌落总数报告方式
|
实例 |
不同稀释度的平均菌落数 |
两个稀释度菌落数之比 |
菌落总数/（CFU）mL |
报告方式/（CFU）mL |
|
10－1 |
10－2 |
10－3 |
|
1 |
1365 |
164 |
20 |
- |
16400 |
16000或1.6×104 |
|
2 |
2760 |
295 |
46 |
1.6 |
37750 |
38000或3.8×104 |
|
3 |
2890 |
271 |
60 |
2.2 |
27100 |
27000或2.7×104 |
|
4 |
150 |
30 |
8 |
2 |
1500 |
1500或1.5×103 |
|
5 |
多不可计 |
1650 |
513 |
- |
513000 |
510000或5.1×103 |
|
6 |
27 |
11 |
5 |
- |
270 |
270或2.7×102 |
|
7 |
多不可计 |
305 |
12 |
- |
30500 |
31000或3.1×104 |
2.总大肠菌群
2.1多管发酵法
2.1.1范围
本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。
本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。
2.1.2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
2.1.2.1总大肠菌群
总大肠菌群指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.1.3培养基与试剂
2.1.3.1乳糖蛋白胨培养液
2.1.3.1.1成分
A蛋白胨 10g
B牛肉膏 3g
C乳糖 5g
D氯化钠 5g
E溴甲酚紫乙醇溶液（16g/l）1mL
F蒸馏水 1000mL
2.1.3.1.2
制法
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整PH为7.2~·7.4，在加入1mL16g/L的溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95kpa（115℃，10lb）高压灭菌20min,贮存于冷暗处备用。
2.1.3.3 伊红美蓝培养基
2.1.3.3.1成分
A蛋白胨 10g
B乳糖 10g
C磷酸氢二钾 2g
D琼脂 20g-30g
E蒸馏水 1000mL
F伊红水溶液（20g/L）20mL
G美蓝水溶液（5g/L）
2.1.3.3.2制法
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正PH为7.2，加入乳糖，混匀后分装，以68.95kpa（115℃，10lb）高压灭菌20min,临用时加热融化琼脂，冷至50℃-55℃，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。
2.1.3.4 革兰氏染色液
2.1.3.4.1 结晶紫染色液
A成分：
a 结晶紫 1g
b 乙醇（95%，体积分数）20mL
c草酸铵水溶液（10g/L）80mL
B制法：将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性。结晶紫溶液防治过久会产生沉淀。
不在可用。
2.1.3.4.2革兰氏碘液
A成分：
a碘 1g
b碘化钾2g
c蒸馏水 300mL
B制法：将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。
2.1.3.4.3 脱色剂
乙醇（95%，体积分数）。
2.1.3.4.4沙黄复染液
A成分：
a沙黄 0.25g
b乙醇（95%，体积分数）10mL
C蒸馏水 90mL
B制法：将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加入蒸馏水。
2.1.3.4.5 染色法
A将培养18h-24h的培养物涂片。
B将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
C滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
D滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s，水洗。
E滴加复染剂，复染1min，水洗，待干，镜检。
2.1.4仪器
2.1.4.1培养箱：36℃±1℃。
2.1.4.2冰箱：0℃~4℃。
2.1.4.3天平。
2.1.4.4显微镜。
2.1.4.5平皿：直径为9cm。
2.1.4.6试管。
2.1.4.7分度吸管：1mL，10mL。
2.1.4.8锥形瓶。
2.1.4.9小倒管。
2.1.4.10载玻片。
2.1.5 检验步骤
2.1.5.1.1取10mL双乳糖蛋白胨培养液中，取1ml水样接种到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1ml水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。
对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接5份10mL水样双料培养基，每份接种10mL水样。
2.1.5.1.2检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.，0.101ml甚至0.1,0.01,0.001mL,每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管。
2.1.5.1.3将接种管置36℃±1℃培养箱内，培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管胨不产气酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。
2.1.5.2分离培养
将产酸产气的发酵管分别转钟在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃±1℃培养箱内培养18h-24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色，镜检和证实试验。
深紫黑色、具有金属光泽的菌落；
紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；
淡紫红色、中心较深的菌落。
2.1.5.3证实试验
经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃±1℃培养箱中培养18h-24h，产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。
2.1.6结果报告
根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL水样中的总大肠菌群可能数值。5管法结果见表2,15管法结果见表3。稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。
