DB61/T1138-2018陕西省地方标准水质粪大肠菌群的测定酶底物法
　　1范围
　　本标准规定了水中粪大肠菌群测定的酶底物法的术语和定义、方法原理、试剂与原料、仪器与设备、 样品、分析步骤、结果计算与表示、质量控制、废物处理的要求。
　　本标准适用于地表水、生活污水和废水中粪大肠菌群的测定。
　　当接种量为300mL时，方法的检出限为3MPN/L,检测范围为3MPN/L~230MPN/L；当接种量为100mL时，方 法的检出限为10MPN/L，采用51孔定量孔板的检测范围为10MPN/L-2005MPN/L，采用97孔定量孔板的检 测范围为10MPN/L-24196MPN/L。
　　2规范性引用文件
　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其新版本适用于本文件。
　　GB/T 5750.12生活饮用水标准检验方法 微生物指标
　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
　　3术语和定义
　　下列术语和定义适用于文件
　　3.1
　　粪大肠菌群 fecal coliforms
　　粪大肠菌群，又称耐热大肠菌群（thermotolerant coliforms）。是一种通常在44.5℃培养发酵乳糖 产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
　　3.2
　　可能数基于泊松分布的一种简介计数方法。
　　4方法原理
　　粪大肠菌群在邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖（ONPG）培养基上培养产生β-D-半乳糖苷酶（β-D- galactosidase）,该酶可以分解色源底物释放出黄色的邻硝基苯酚，通过颜色变化定性，MPN法定量。
　　5.试剂与材料
　　5.1除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682中规定的水。
　　5.2培养基选择市售商品化酶底物法试剂，或自行配置培养基，基本成分参照附录A。
　　5.3硫代硫酸钠（NA2S2O3）。
　　5.4乙二胺四乙酸二钠（EDTA-NA2）。
　　5.5氯化钠（NACL）。
　　5.6硫代硫酸钠溶液：ρ（NA2S2O3）=0.10g/ml。
　　注：称取硫代硫酸钠（5.2）10g，适量水溶解，定容至100ml，临用现配。
　　5.7乙二胺四乙酸二钠（5.3）15g,适量水溶解，定容至100ml，摇匀，常温下可存放30d。
　　5.8灭菌生理盐水：ρ（NaCl）=0.9%(m/v)。
　　注：称取氯化钠（5.4）0.9g，适量水溶解，定容至100mL，经121℃高压蒸汽灭菌20min,备用。
　　6 仪器与设备
　　6.1采样瓶：500mL棕色磨口玻璃瓶。
　　6.2恒温培养箱：44.5℃±0.5℃。
　　6.3高压蒸汽灭菌器：121℃、0.101Mpa。
　　6.4冰箱：0℃~4℃。
　　6.5恒温干燥箱：0℃~300℃。
　　6.6程控定量封口机：带51孔和97孔胶托。
　　6.751孔和97孔定量孔板：无菌。
　　6.8100mL无菌取样瓶。
　　6.9试管： 15mm×150mm,带透气胶塞。
　　6.10标准阳性比色盘。
　　6.11移液管：1mL、10mL，也可采用体积可调式移液器。
　　6.12锥形瓶：500mL。
　　6.13量筒：100ml。
　　6.14移液管、试管、量筒、采样瓶等均需包扎经121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。
　　7样品
　　7.1样品采集
　　7.1.1与其他项目一同采样时，先单独采集微生物样品。采样瓶（6.1）不得用水样洗涤，按照无菌操作的要求采集水样于灭菌的采样瓶中。
　　7.12采集江、河、湖、库等地表水时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，距水面约 10cm~15cm处，可握住瓶子水平前推。采样后瓶内要留足够的空间，一般采样量为采样瓶容量的80%左 右。采好水样后，迅速盖好瓶盖并扎上无菌包装纸。
　　7.13从龙头装置采集样品时，要选用完好无损的龙头，采水前将龙头打开至大，防水3min~5min；然 后将龙头关闭，用火焰灼烧3min灭菌，开足龙头，再放水1min.采样时控制水流速度。
　　7.14采集地表水、废水样品及一定深度的水样时，可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点 进行分层采样时，应自上而下进行。
　　7.2样品保持
　　样品在10℃一下冷藏运输，运输时间不超过6h。实验室接样后不能立即展开检测的，应将样品放入0℃ ~4℃冰箱（6.4）保存，在2h内检测。
　　7.3干扰和消除
　　酸性样品，应在分析前按无菌操作要求调节样品pH值7.0~8.0。在采样瓶灭菌前加入0.4mL硫代硫酸钠 溶液（5.5）以出去余氯对细菌的抑制作用；在采样瓶灭菌前加入1.2mL乙二胺乙酸二钠溶液（5.6）以 除去重金属对细菌的抑制作用。
　　8分析步骤
　　8.1水样接种量
　　水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样的接种量，水样的接种量可参考表1。
　　8.2接种
　　8.2.1清洁水样
　　8.2.1.1接种量为300mL时，接种水样为2份100mL和10份10mL。
　　8.2.1.2量取2份100mL时，用无菌取样瓶（6.8）量取100mL水样，加入2.7g+_0.5g酶底物法试剂（5.1 ），充分混匀溶解，将溶解液倒入51孔或97孔定量孔板（6.7）中根据水样污染程度选择合适的孔板， 排除气泡后用程控定量封口机（6.6）进行封口。
　　8.2.2.2接种量＜100mL时，以104为例，取1mL水样加入100mL无菌取样瓶中，用灭菌生理盐水（5.7） 稀释定容至刻度线，混匀，再取稀释后的水样1mL，重复上述操作，一下操作按照8.2.2.1进行。
　　8.3培养
　　将8.2.1和8.2.2中接种后的取样瓶、试管或孔板放入恒温培养箱中44.5+0.5培养24h+2h。
　　8.4对照试验
　　8.4.1空白试验
　　用灭菌生理盐水代替样品按照8.2和8.3进行测定。
　　8.4.2阳性及阴性对照
　　8.4.2.1粪大肠菌群测定的阳性菌株为大肠埃希氏菌，阴性菌株为产气肠杆菌。
　　8.4.2.2标准菌株的菌悬液浓度建议使用0.3麦氏浓度值~0.4麦氏浓度值，取适量后按照8.2.2.2进行接 种，按8.3培养后，大肠埃希氏菌呈现阳性反应，产气肠杆菌呈现阴性反应。
　　8.5结果判读
　　取样瓶、试管或孔板经培养后，对照阳性比色盘（6.10），水样变黄判断为粪大肠菌群阳性，不变色 判断为粪大肠菌群阴性。记录取样瓶、试管阳性个数，51孔定量孔板（6.7）记录大孔阳性数，97孔定 量孔板（6.7）分别记录大孔和小孔阳性数。
　　9结果计算与表示
　　9.1结果计算
　　9.1.1接种量为300ml
　　根据8.5中取样瓶和试管阳性个数，查MPN表（附录B）可得每升水样中粪大肠菌群MPN数。
　　9.1.2接种量≤100mL
　　根据8.5中51孔定量孔板阳性数，查51孔MPN表（附录C）；根据8.5中97孔定量孔大孔和小孔的阳性数 ，查97孔MPN表（附录D），再根据样品的稀释度，按公式（1）换算为每1L水样中粪大肠菌群的浓度。
　　10质量控制
　　10.1实验室应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。
　　10.2每批培养基应按本标准8.4的要求采用有证标准菌株进行阳性、阴性对照试验（见表2）。
　　10.3宜选用市售商品化培养基，以减少配制中产生的误差。
　　10.4应定期使用有证标准物质/样品进行质量控制。
　　10.5每批样品至少测定10%的平行双样，测试结果以算数平均值计算。
　　表2阳性、阴性对照菌株参考表
　　菌株名称   英文名   菌株编号
　　大肠埃希氏菌      Escherchina coli     CICC 24176
　　产气肠杆菌        Enterobacter aerogenes      CICC 10293 或 ATCC 13048
　　11废物处理
　　使用后的器皿及废弃物应经121℃高压蒸汽灭菌30min处理。