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酶底物法测定水中总大肠菌群质量控制研究
添加时间:2021-05-28
  酶底物法测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌质量控制研究
  1引言
  
  总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌是人和温血动物肠道中的正常寄生细菌,是水体粪便污染的指示菌,也是水质评价的重要微生物指标之一。总大肠菌群是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,包括埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸菌属、克雷伯菌属等菌属。粪大肠菌群又叫耐热大肠菌群,是总大肠菌群中的一部分,主要包括埃希氏菌属和耐热克雷伯菌属,其能够更为贴切反映水体受粪便污染程度。大肠埃希氏菌又称大肠杆菌,是总大肠菌群、粪大肠菌群的主要种类。总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌常用的测定方法主要有多管发酵法、滤膜法、纸片法和酶底物法。酶底物法由于具有检出限低、准确度高、操作方便、时效性高等优点,从而得到了广泛应用。但目前对酶底物法测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的质量控制研究仍较少,本文将从实验部分、实验室要求、实验室人员、工作菌悬液、设备、标准阳性比色盘和废弃物处理等方面对实验室质量控制进行研究,为检测结果的准确性提供保障,能够更好地服务环境保护工作。
  
  2实验部分
  
  2.1试剂和材料
  
  培养基;硫代硫酸钠溶液:0.10g/mL;乙二胺四乙酸二钠溶液:0.15g/mL;97孔定量盘;标准阳性比色盘。
  
  2.2仪器和设备
  
  高压蒸汽灭菌器:121℃可调;恒温培养箱:允许温
  
  度偏差37℃±1℃、44.5℃±0.5℃;程控定量封口
  
  机;紫外灯:波长365~366nm。
  
  2.3标准菌株
  
  (1)金黄色葡萄球菌:26003-5a28-2(F2),中国药品食品检定研究院。
  
  (2)产气肠杆菌:CICC10293(F2),中国工业微生物
  
  菌种保藏管理中心。
  
  (3)大肠埃希氏菌:44102-3a23-3(F2),中国药品食品检定研究院。
  
  2.4样品测定方法
  
  根据《水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法》(HJ1001-2018)进行样品采集、保存、接种、培养以及结果判读、结果计算。总大肠菌群、大肠埃希氏菌于37℃±1℃下培养24h,粪大肠菌群于44.5℃±0.5℃下培养24h。每次实验应填写恒温培养箱温控记录。
  
  2.5实验室空白
  
  每批样品都要用无菌水进行实验室空白测定。量取100mL无菌水于灭菌后的三角瓶,加入2.7g±0.5g培养基粉末,充分混匀,完全溶解后全部倒入97孔定量盘内,赶除气泡,程控定量封口机封口。总大肠菌群、大肠埃希氏菌于37℃±1℃下培养24h,粪大肠菌群于44.5℃±0.5℃下培养24h。2.6阴性和阳性对照将标准储存菌株制成300~3000个/mL的工作菌悬液,取100mL菌悬液于灭菌后的三角瓶中,加入2.7g±0.5g培养基粉末,充分混匀至完全溶解后,全部倒入97孔定量盘内,以手抚平97孔定量盘背面,赶除孔内气泡,然后用程控定量封口机封口。将封口后的97孔定量盘放入特定温度的恒温培养箱中培养24h。
  
  2.7精密度测定
  
  对低、中和高3种浓度的实际水样进行测定,每个样品平行测定6次,以验证方法精密度。
  
  2.8准确度测定
  
  对有证标准样品进行测定,以验证方法准确度。
  
  3质量控制
  
  3.1实验室要求
  
  实验室空间安排要合理,需要配备:①准备室:进行培养基制备,需明确标示出无菌区和非无菌区;②无菌室:放置超净工作台,以用于接种水样;③培养室:主要放置用于培养微生物的恒温培养箱;④鉴定室:放置生物安全柜,用于转移培养微生物;⑤高温室:主要用于对废弃物和其他器具进行高温消毒。无菌室在使用前后都要进行清洁消毒处理,并每月对无菌室进行沉降菌测试。实验室要求通风良好、避免灰尘、温度恒定,室内墙壁和地板要使用防透水材料,工作台应使用光滑、防水、抗腐蚀、接缝少的材料,保持室内空气的清洁和实验室用具的整洁。
  
  3.2实验室人员
  
  实验员应具有一定的专业理论知识和技能,并获得专业考试证书;应积极参加培训和理论知识学习,不断提高业务技术水平并及时掌握微生物检测新技术;定期进行方法比对及人员比对;应具有严谨认真的工作态度。
  
  3.3工作菌悬液制备
  
  标准菌株需要从标准菌种保藏中心或其他有效认证的商业机构获得,严格按照使用说明书进行复苏,并按照《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》(GB4789.28-2013)制备成标准储存菌株,于-20℃低温冷藏箱中保存。自-20℃低温冷藏箱取出标准储存菌株一支,将菌液全部倒入盛有50mL适合的液体培养基中,于36.5℃、30r/min水浴恒温振荡器中培养18h。然后验证菌株的纯度和形态,挑取2~3个典型菌落于36.5℃、30r/min水浴恒温振荡器中培养18h。将培养后的菌悬液进行稀释,以血球计数板初步计数每小格2~3个活动菌为宜,计算出菌液浓度,再根据菌液浓度稀释至300~3000个/mL。
  
  3.4设备
  
  培养总大肠菌群、大肠埃希氏菌所用恒温培养箱应达到37℃±1℃,培养粪大肠菌群所用的培养箱应达到44.5℃±0.5℃,每天都要检查培养箱温度是否稳定无误,填写控温使用记录。高压蒸汽灭菌器每次使用时应用121℃压力蒸汽灭菌化学指示卡检查是否符合灭菌条件,每季度进行一次嗜热脂肪肝菌芽孢菌片灭菌效果评价。计量部门对上述设备每年校准一次,检查温度是否达到要求。实验人员根据校准证书中的温度偏差进行修正,并在设备正面标明修正因子。紫外线灯需定期检测,包括对紫外线波长、强度及评价其消毒效果的物理学指标和生物学指标的检测。
  
  3.5标准阳性比色盘
  
  标准阳性比色盘应置于干燥阴凉处避光存放,孔内的液体不少于其体积的2/3,否则需要重新更换。随时观察比色盘以防比色盘内液体颜色发生变化,影响数据准确性。无特殊情况需按其有效期提前更换。
  
  3.6废弃物处理
  
  实验过程产生的具有潜在危险的废弃物,需要进行高压蒸汽灭菌,在确保微生物灭活后,液体废弃物倒入下水道,菌株培养的废弃物应放入标有生物危害的黄色塑料袋中,交由有资质的单位处理。对于实验室产生的其他一般废弃物,将其放入一般垃圾袋中即可。
  
  4结果讨论
  
  4.1空白对照
  
  培养后97孔定量盘均无任何颜色变化,证明实验室空白合格。
  
  4.2阴性和阳性对照
  
  将各标准菌株制成300~3000个/mL的菌悬液,将菌悬液按方法要求接种培养,结果显示阳性菌株呈现定量盘颜色变为黄色为阳性反应,阴性菌株呈现定量盘颜色不发生变化为阴性反应,证明阴阳性对照试验合格。
  
  4.3精密度
  
  将低、中和高3种不同浓度样品分别对总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群进行平行测定6次,结果见表1~3。结果显示,低、中和高浓度样品中总大肠菌群测定的相对标准偏差分别为1.2%、1.0%和1.9%,粪大肠菌群测定的相对标准偏差分别为1.7%、2.7%和5.9%,大肠埃希氏菌测定的相对标准偏差分别为1.7%、1.4%和7.2%,均满足要求。
  
  4.4准确度
  
总大肠菌群标准样品QC-FD-035标准值为5200(2300~12000)MPN/100mL,测定值为4279MPN/100mL;粪大肠菌群标准样品QC-FD-006标准值为13000MPN/mL,测定值为12439MPN/mL;肠埃希氏标准样品QC-FD-033标准值为3100(1000~9500)MPN/100mL,测定值为2001MPN/100mL,均满足要求。
表1 总大肠菌群的测定结果
 
表2 粪大肠菌群的测定结果

 
表3 大肠埃希氏菌的测定结果

 
综上所述,采用酶底物法检测水中的总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌,对样品进行全程序空白对照,阴阳性对照试验,以及对准确度进行验证,结果都在质量控制范围内。按照以上质量控制要求,加强管理,可获得 数 据,满足方法要求。酶底物法具有简便、精准、快速、方法检出限低等优点,使 酶 底 物 法测定总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的应用越来越广泛,所以,做好酶底物法测定水中总大肠的质量控制研究具有非常重要的意义。
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