酶底物法测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌质量控制研究
　　１引言
　　
　　总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌是人和温血动物肠道中的正常寄生细菌，是水体粪便污染的指示菌，也是水质评价的重要微生物指标之一。总大肠菌群是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，包括埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸菌属、克雷伯菌属等菌属。粪大肠菌群又叫耐热大肠菌群，是总大肠菌群中的一部分，主要包括埃希氏菌属和耐热克雷伯菌属，其能够更为贴切反映水体受粪便污染程度。大肠埃希氏菌又称大肠杆菌，是总大肠菌群、粪大肠菌群的主要种类。总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌常用的测定方法主要有多管发酵法、滤膜法、纸片法和酶底物法。酶底物法由于具有检出限低、准确度高、操作方便、时效性高等优点，从而得到了广泛应用。但目前对酶底物法测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的质量控制研究仍较少，本文将从实验部分、实验室要求、实验室人员、工作菌悬液、设备、标准阳性比色盘和废弃物处理等方面对实验室质量控制进行研究，为检测结果的准确性提供保障，能够更好地服务环境保护工作。
　　
　　２实验部分
　　
　　２．１试剂和材料
　　
　　培养基；硫代硫酸钠溶液：０．１０ｇ／ｍＬ；乙二胺四乙酸二钠溶液：０．１５ｇ／ｍＬ；９７孔定量盘；标准阳性比色盘。
　　
　　２．２仪器和设备
　　
　　高压蒸汽灭菌器：１２１℃可调；恒温培养箱：允许温
　　
　　度偏差３７℃±１℃、４４．５℃±０．５℃；程控定量封口
　　
　　机；紫外灯：波长３６５～３６６ｎｍ。
　　
　　２．３标准菌株
　　
　　（１）金黄色葡萄球菌：２６００３－５ａ２８－２（Ｆ２），中国药品食品检定研究院。
　　
　　（２）产气肠杆菌：ＣＩＣＣ１０２９３（Ｆ２），中国工业微生物
　　
　　菌种保藏管理中心。
　　
　　（３）大肠埃希氏菌：４４１０２－３ａ２３－３（Ｆ２），中国药品食品检定研究院。
　　
　　２．４样品测定方法
　　
　　根据《水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法》（ＨＪ１００１－２０１８）进行样品采集、保存、接种、培养以及结果判读、结果计算。总大肠菌群、大肠埃希氏菌于３７℃±１℃下培养２４ｈ，粪大肠菌群于４４．５℃±０．５℃下培养２４ｈ。每次实验应填写恒温培养箱温控记录。
　　
　　２．５实验室空白
　　
　　每批样品都要用无菌水进行实验室空白测定。量取１００ｍＬ无菌水于灭菌后的三角瓶，加入２．７ｇ±０．５ｇ培养基粉末，充分混匀，完全溶解后全部倒入９７孔定量盘内，赶除气泡，程控定量封口机封口。总大肠菌群、大肠埃希氏菌于３７℃±１℃下培养２４ｈ，粪大肠菌群于４４．５℃±０．５℃下培养２４ｈ。２．６阴性和阳性对照将标准储存菌株制成３００～３０００个／ｍＬ的工作菌悬液，取１００ｍＬ菌悬液于灭菌后的三角瓶中，加入２．７ｇ±０．５ｇ培养基粉末，充分混匀至完全溶解后，全部倒入９７孔定量盘内，以手抚平９７孔定量盘背面，赶除孔内气泡，然后用程控定量封口机封口。将封口后的９７孔定量盘放入特定温度的恒温培养箱中培养２４ｈ。
　　
　　２．７精密度测定
　　
　　对低、中和高３种浓度的实际水样进行测定，每个样品平行测定６次，以验证方法精密度。
　　
　　２．８准确度测定
　　
　　对有证标准样品进行测定，以验证方法准确度。
　　
　　３质量控制
　　
　　３．１实验室要求
　　
　　实验室空间安排要合理，需要配备：①准备室：进行培养基制备，需明确标示出无菌区和非无菌区；②无菌室：放置超净工作台，以用于接种水样；③培养室：主要放置用于培养微生物的恒温培养箱；④鉴定室：放置生物安全柜，用于转移培养微生物；⑤高温室：主要用于对废弃物和其他器具进行高温消毒。无菌室在使用前后都要进行清洁消毒处理，并每月对无菌室进行沉降菌测试。实验室要求通风良好、避免灰尘、温度恒定，室内墙壁和地板要使用防透水材料，工作台应使用光滑、防水、抗腐蚀、接缝少的材料，保持室内空气的清洁和实验室用具的整洁。
　　
　　３．２实验室人员
　　
　　实验员应具有一定的专业理论知识和技能，并获得专业考试证书；应积极参加培训和理论知识学习，不断提高业务技术水平并及时掌握微生物检测新技术；定期进行方法比对及人员比对；应具有严谨认真的工作态度。
　　
　　３．３工作菌悬液制备
　　
　　标准菌株需要从标准菌种保藏中心或其他有效认证的商业机构获得，严格按照使用说明书进行复苏，并按照《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》（ＧＢ４７８９．２８－２０１３）制备成标准储存菌株，于－２０℃低温冷藏箱中保存。自－２０℃低温冷藏箱取出标准储存菌株一支，将菌液全部倒入盛有５０ｍＬ适合的液体培养基中，于３６．５℃、３０ｒ／ｍｉｎ水浴恒温振荡器中培养１８ｈ。然后验证菌株的纯度和形态，挑取２～３个典型菌落于３６．５℃、３０ｒ／ｍｉｎ水浴恒温振荡器中培养１８ｈ。将培养后的菌悬液进行稀释，以血球计数板初步计数每小格２～３个活动菌为宜，计算出菌液浓度，再根据菌液浓度稀释至３００～３０００个／ｍＬ。
　　
　　３．４设备
　　
　　培养总大肠菌群、大肠埃希氏菌所用恒温培养箱应达到３７℃±１℃，培养粪大肠菌群所用的培养箱应达到４４．５℃±０．５℃，每天都要检查培养箱温度是否稳定无误，填写控温使用记录。高压蒸汽灭菌器每次使用时应用１２１℃压力蒸汽灭菌化学指示卡检查是否符合灭菌条件，每季度进行一次嗜热脂肪肝菌芽孢菌片灭菌效果评价。计量部门对上述设备每年校准一次，检查温度是否达到要求。实验人员根据校准证书中的温度偏差进行修正，并在设备正面标明修正因子。紫外线灯需定期检测，包括对紫外线波长、强度及评价其消毒效果的物理学指标和生物学指标的检测。
　　
　　３．５标准阳性比色盘
　　
　　标准阳性比色盘应置于干燥阴凉处避光存放，孔内的液体不少于其体积的２／３，否则需要重新更换。随时观察比色盘以防比色盘内液体颜色发生变化，影响数据准确性。无特殊情况需按其有效期提前更换。
　　
　　３．６废弃物处理
　　
　　实验过程产生的具有潜在危险的废弃物，需要进行高压蒸汽灭菌，在确保微生物灭活后，液体废弃物倒入下水道，菌株培养的废弃物应放入标有生物危害的黄色塑料袋中，交由有资质的单位处理。对于实验室产生的其他一般废弃物，将其放入一般垃圾袋中即可。
　　
　　４结果讨论
　　
　　４．１空白对照
　　
　　培养后９７孔定量盘均无任何颜色变化，证明实验室空白合格。
　　
　　４．２阴性和阳性对照
　　
　　将各标准菌株制成３００～３０００个／ｍＬ的菌悬液，将菌悬液按方法要求接种培养，结果显示阳性菌株呈现定量盘颜色变为黄色为阳性反应，阴性菌株呈现定量盘颜色不发生变化为阴性反应，证明阴阳性对照试验合格。
　　
　　４．３精密度
　　
　　将低、中和高３种不同浓度样品分别对总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群进行平行测定６次，结果见表１～３。结果显示，低、中和高浓度样品中总大肠菌群测定的相对标准偏差分别为１．２％、１．０％和１．９％，粪大肠菌群测定的相对标准偏差分别为１．７％、２．７％和５．９％，大肠埃希氏菌测定的相对标准偏差分别为１．７％、１．４％和７．２％，均满足要求。
　　
　　４．４准确度
　　
总大肠菌群标准样品ＱＣ－ＦＤ－０３５标准值为５２００（２３００～１２０００）ＭＰＮ／１００ｍＬ，测定值为４２７９ＭＰＮ／１００ｍＬ；粪大肠菌群标准样品ＱＣ－ＦＤ－００６标准值为１３０００ＭＰＮ／ｍＬ，测定值为１２４３９ＭＰＮ／ｍＬ；肠埃希氏标准样品ＱＣ－ＦＤ－０３３标准值为３１００（１０００～９５００）ＭＰＮ／１００ｍＬ，测定值为２００１ＭＰＮ／１００ｍＬ，均满足要求。
表１ 总大肠菌群的测定结果
 
表２ 粪大肠菌群的测定结果

 
表３ 大肠埃希氏菌的测定结果

 
综上所述，采用酶底物法检测水中的总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌，对样品进行全程序空白对照，阴阳性对照试验，以及对准确度进行验证，结果都在质量控制范围内。按照以上质量控制要求，加强管理，可获得 数 据，满足方法要求。酶底物法具有简便、精准、快速、方法检出限低等优点，使 酶 底 物 法测定总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的应用越来越广泛，所以，做好酶底物法测定水中总大肠的质量控制研究具有非常重要的意义。