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科普知识
水质粪大肠菌群酶底物法陕西省环保新标准
添加时间:2019-06-04
    DB61/T1138-2018陕西省地方标准水质粪大肠菌群的测定酶底物法
  1范围
  本标准规定了水中粪大肠菌群测定的酶底物法的术语和定义、方法原理、试剂与原料、仪器与设备、 样品、分析步骤、结果计算与表示、质量保证和质量控制、废物处理的要求。
  本标准适用于地表水、生活污水和废水中粪大肠菌群的测定。
  当接种量为300mL时,方法的检出限为3MPN/L,检测范围为3MPN/L~230MPN/L;当接种量为100mL时,方 法的检出限为10MPN/L,采用51孔定量孔板的检测范围为10MPN/L-2005MPN/L,采用97孔定量孔板的检 测范围为10MPN/L-24196MPN/L。
  2规范性引用文件
  下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本文件。
  GB/T 5750.12生活饮用水标准检验方法 微生物指标
  GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
  3术语和定义
  下列术语和定义适用于文件
  3.1
  粪大肠菌群 fecal coliforms
  粪大肠菌群,又称耐热大肠菌群(thermotolerant coliforms)。是一种通常在44.5℃培养发酵乳糖 产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
  3.2
  最可能数基于泊松分布的一种简介计数方法。
  4方法原理
  粪大肠菌群在邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖(ONPG)培养基上培养产生β-D-半乳糖苷酶(β-D- galactosidase),该酶可以分解色源底物释放出黄色的邻硝基苯酚,通过颜色变化定性,MPN法定量。
  5.试剂与材料
  5.1除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T6682中规定的一级水。
  5.2培养基选择市售商品化酶底物法试剂,或自行配置培养基,基本成分参照附录A。
  5.3硫代硫酸钠(NA2S2O3)。
  5.4乙二胺四乙酸二钠(EDTA-NA2)。
  5.5氯化钠(NACL)。
  5.6硫代硫酸钠溶液:ρ(NA2S2O3)=0.10g/ml。
  注:称取硫代硫酸钠(5.2)10g,适量水溶解,定容至100ml,临用现配。
  5.7乙二胺四乙酸二钠(5.3)15g,适量水溶解,定容至100ml,摇匀,常温下可存放30d。
  5.8灭菌生理盐水:ρ(NaCl)=0.9%(m/v)。
  注:称取氯化钠(5.4)0.9g,适量水溶解,定容至100mL,经121℃高压蒸汽灭菌20min,备用。
  6 仪器与设备
  6.1采样瓶:500mL棕色磨口玻璃瓶。
  6.2恒温培养箱:44.5℃±0.5℃。
  6.3高压蒸汽灭菌器:121℃、0.101Mpa。
  6.4冰箱:0℃~4℃。
  6.5恒温干燥箱:0℃~300℃。
  6.6程控定量封口机:带51孔和97孔胶托。
  6.751孔和97孔定量孔板:无菌。
  6.8100mL无菌取样瓶。
  6.9试管: 15mm×150mm,带透气胶塞。
  6.10标准阳性比色盘。
  6.11移液管:1mL、10mL,也可采用体积可调式移液器。
  6.12锥形瓶:500mL。
  6.13量筒:100ml。
  6.14移液管、试管、量筒、采样瓶等均需包扎经121℃高压蒸汽灭菌20min,备用。
  7样品
  7.1样品采集
  7.1.1与其他项目一同采样时,先单独采集微生物样品。采样瓶(6.1)不得用水样洗涤,按照无菌操作的要求采集水样于灭菌的采样瓶中。
  7.12采集江、河、湖、库等地表水时,可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中,距水面约 10cm~15cm处,可握住瓶子水平前推。采样后瓶内要留足够的空间,一般采样量为采样瓶容量的80%左 右。采好水样后,迅速盖好瓶盖并扎上无菌包装纸。
  7.13从龙头装置采集样品时,要选用完好无损的龙头,采水前将龙头打开至最大,防水3min~5min;然 后将龙头关闭,用火焰灼烧3min灭菌,开足龙头,再放水1min.采样时控制水流速度。
  7.14采集地表水、废水样品及一定深度的水样时,可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点 进行分层采样时,应自上而下进行。
  7.2样品保持
  样品在10℃一下冷藏运输,运输时间不超过6h。实验室接样后不能立即展开检测的,应将样品放入0℃ ~4℃冰箱(6.4)保存,在2h内检测。
  7.3干扰和消除
  酸性样品,应在分析前按无菌操作要求调节样品pH值7.0~8.0。在采样瓶灭菌前加入0.4mL硫代硫酸钠 溶液(5.5)以出去余氯对细菌的抑制作用;在采样瓶灭菌前加入1.2mL乙二胺乙酸二钠溶液(5.6)以 除去重金属对细菌的抑制作用。
  8分析步骤
  8.1水样接种量
  水样充分混匀后,根据水样污染的程度确定水样的接种量,水样的接种量可参考表1。
  8.2接种
  8.2.1清洁水样
  8.2.1.1接种量为300mL时,接种水样为2份100mL和10份10mL。
  8.2.1.2量取2份100mL时,用无菌取样瓶(6.8)量取100mL水样,加入2.7g+_0.5g酶底物法试剂(5.1 ),充分混匀溶解,将溶解液倒入51孔或97孔定量孔板(6.7)中根据水样污染程度选择合适的孔板, 排除气泡后用程控定量封口机(6.6)进行封口。
  8.2.2.2接种量<100mL时,以104为例,取1mL水样加入100mL无菌取样瓶中,用灭菌生理盐水(5.7) 稀释定容至刻度线,混匀,再取稀释后的水样1mL,重复上述操作,一下操作按照8.2.2.1进行。
  8.3培养
  将8.2.1和8.2.2中接种后的取样瓶、试管或孔板放入恒温培养箱中44.5+0.5培养24h+2h。
  8.4对照试验
  8.4.1空白试验
  用灭菌生理盐水代替样品按照8.2和8.3进行测定。
  8.4.2阳性及阴性对照
  8.4.2.1粪大肠菌群测定的阳性菌株为大肠埃希氏菌,阴性菌株为产气肠杆菌。
  8.4.2.2标准菌株的菌悬液浓度建议使用0.3麦氏浓度值~0.4麦氏浓度值,取适量后按照8.2.2.2进行接 种,按8.3培养后,大肠埃希氏菌呈现阳性反应,产气肠杆菌呈现阴性反应。
  8.5结果判读
  取样瓶、试管或孔板经培养后,对照阳性比色盘(6.10),水样变黄判断为粪大肠菌群阳性,不变色 判断为粪大肠菌群阴性。记录取样瓶、试管阳性个数,51孔定量孔板(6.7)记录大孔阳性数,97孔定 量孔板(6.7)分别记录大孔和小孔阳性数。
  9结果计算与表示
  9.1结果计算
  9.1.1接种量为300ml
  根据8.5中取样瓶和试管阳性个数,查MPN表(附录B)可得每升水样中粪大肠菌群MPN数。
  9.1.2接种量≤100mL
  根据8.5中51孔定量孔板阳性数,查51孔MPN表(附录C);根据8.5中97孔定量孔大孔和小孔的阳性数 ,查97孔MPN表(附录D),再根据样品的稀释度,按公式(1)换算为每1L水样中粪大肠菌群的浓度。
  10质量保证和质量控制
  10.1实验室应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。
  10.2每批培养基应按本标准8.4的要求采用有证标准菌株进行阳性、阴性对照试验(见表2)。
  10.3宜选用市售商品化培养基,以减少配制中产生的误差。
  10.4应定期使用有证标准物质/样品进行质量控制。
  10.5每批样品至少测定10%的平行双样,测试结果以算数平均值计算。
  表2阳性、阴性对照菌株参考表
  菌株名称   英文名   菌株编号
  大肠埃希氏菌      Escherchina coli     CICC 24176
  产气肠杆菌        Enterobacter aerogenes      CICC 10293 或 ATCC 13048
  11废物处理
  使用后的器皿及废弃物应经121℃高压蒸汽灭菌30min处理。
没安装畅言模块
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